May 29, 2024
구슬
Communications Biology 5권, 기사 번호: 1206(2022) 이 기사 인용 3909 액세스 4 Altmetric Metrics 세부 정보 G 단백질 결합 수용체의 작용제 구동 인산화 분석
커뮤니케이션 생물학 5권, 기사 번호: 1206(2022) 이 기사 인용
3909 액세스
4 알트메트릭
측정항목 세부정보
G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 작용제 구동 인산화 분석은 수용체 활성화 상태 및 리간드 약리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나 현재까지 높은 처리량 응용 프로그램을 사용하여 GPCR 인산화를 평가하는 것은 어려운 일이었습니다. 우리는 멀티웰 세포 배양 플레이트에서 완전히 수행될 수 있는 작용제 유발 GPCR 인산화의 정량적 평가를 위한 비드 기반 면역분석법을 개발하고 검증했습니다. 이 분석법에는 자기 비드를 사용하여 친화성 태그가 지정된 수용체의 면역침전과 인산화 상태 특이적 및 인산화 상태 독립적인 항-GPCR 항체를 사용한 단백질 검출이 포함됩니다. 개념 증명으로 5가지 원형 GPCR(MOP, C5a1, D1, SST2, CB2)을 다양한 작용제 및 길항제로 처리하고 농도-반응 곡선을 생성했습니다. 그런 다음 선택적 세포 GPCR 키나제(GRK) 억제제 분석법을 확립하기 위한 접근 방식을 확장하여 선택적 GRK5/6 억제제(LDC8988)와 매우 강력한 범GRK 억제제(LDC9728)를 신속하게 식별했습니다. 결론적으로, 이 다목적 GPCR 인산화 분석은 리간드 프로파일링 및 억제제 스크리닝에 광범위하게 사용될 수 있습니다.
G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 다양한 화학적, 물리적 자극의 효과를 중재하는 중요한 신호 변환기이며 많은 인간 질병의 주요 약물 표적을 나타냅니다. GPCR은 7개의 막횡단 도메인을 갖는 균일한 구조를 가지므로 7개의 막횡단 수용체(7TMR)라고도 합니다. 내인성 리간드 또는 외인성 작용제에 의한 활성화는 G 단백질 결합 수용체 키나제(GRK)라고 불리는 키나제 계열에 의해 인식되는 GPCR 형태 변화를 초래합니다1. 활성화된 수용체를 인식하는 GRK의 독특한 능력으로 인해 세포내 세린 및 트레오닌 잔기2,3에서 작용제 의존성 인산화가 발생합니다. 또한, 단백질 키나아제 A, C 및 기타 세린/트레오닌 키나아제4,5,6를 포함한 두 번째 메신저 조절 키나아제도 GPCR 인산화에 참여할 수 있습니다. GPCR의 인산화는 주로 수용체의 탈감작화 및 내재화를 시작하는 생물학적, 약리학적으로 중요한 과정입니다7,8. 인산화는 또한 β-어레스틴과 같은 세포내 어댑터 단백질과 GPCR의 상호작용을 증가시켜 두 번째 신호 전달을 유발할 수 있습니다9,10,11,12.
초기 GPCR 연구는 높은 수준의 방사성을 요구하고 개별 인산화된 세린 및 트레오닌 잔기를 식별하는 데 사용할 수 없는 방사성 전세포 인산화 분석을 기반으로 했습니다. 이후에는 인단백질체학(phosphoproteomics) 분석에 대한 연구가 진행되었으며 이를 통해 제한된 정량적 정보를 얻었습니다. 현재 널리 사용되는 접근법은 GPCR14,15,16,17,18의 인산화 상태를 특이적으로 인식하는 항체를 기반으로 합니다. 가능한 경우 포스포사이트 특이적 항-GPCR 항체는 수용체 인산화의 시간적 및 공간적 역학을 해결하고, 관련 키나제 및 포스파타제를 식별하고, 수용체 활성화를 감지하고, 새로운 리간드의 약리학적 특성을 프로파일링하는 탁월한 도구입니다. 그러나 포스포사이트 특이적 항체는 기술적으로 까다롭고 작은 샘플 크기로 제한되며 정량화하기 어려운 면역블롯팅 접근법에 주로 사용됩니다.
제약 및 학술 연구에서는 대규모 화학 라이브러리의 스크리닝을 용이하게 하기 위해 처리량이 많은 분석이 필요한 경우가 많습니다. 수용체 결합, G-단백질 신호전달 및 어레스틴 모집은 이용 가능한 방법론으로 평가할 수 있지만, GPCR 인산화를 결정하기 위한 적절한 기술은 현재 이용 가능하지 않습니다. 따라서 우리는 멀티웰 세포 배양 플레이트에서 전적으로 수행할 수 있고 중간에서 높은 처리량 응용에 도움이 되는 정량적 인산화 면역분석법의 개발에서 포스포사이트 특이적 항-GPCR 항체를 활용하려는 동기를 부여받았습니다(그림 1). 이 분석법은 사실상 모든 7개 막횡단 수용체에 적용할 수 있기 때문에 '7TM 인산화 분석법'이라고 합니다.
95% confluency. The cells were cultured in the presence or absence of the agonist [D-Ala2,N-MePhe4,Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) and then lysed in detergent buffer containing protease and protein phosphatase (PPase) inhibitors. After plate centrifugation, lysates were transferred to U-bottom 96-well plates. MOPs were then immunoprecipitated using mouse anti-HA antibody-coated magnetic beads. After washing the beads under magnetic force, either phosphosite-specific rabbit antibodies that specifically recognized the S375-phosphorylated form of MOP (pS375-MOP) or antibodies that detected MOP in a phosphorylation-independent manner (np-MOP) were added to the cells (Fig. 2a). Primary antibody binding was then detected using commercially available enzyme-labeled secondary antibodies followed by addition of the respective enzyme substrate solution. The color reaction in DAMGO-treated wells was stopped when the optical density (OD) read at 405 nm reached 1.2, typically within 2 to 8 min. Under identical conditions, the OD of untreated wells was approximately 0.2, suggesting that DAMGO-induced S375 phosphorylation of MOP was specifically detected within the optimal dynamic range for 2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)-based enzyme immunoassay substrates (Fig. 2b). Omission of the magnetic beads or the primary or secondary antibodies or the use of untransfected cells resulted in OD readings of 0.2 or less. When DAMGO was added at different concentrations ranging from 10 nM to 10 µM in wells assayed using the anti-pS375-MOP antibody, we observed increasing OD readings with data points following the typical shape of a sigmoidal concentration–response curve (Fig. 2c). In contrast, all wells assayed using the anti-np-MOP antibody yielded an OD reading of ~0.8, independent of agonist exposure, indicating that all the MOPs had been identified (Fig. 2c). Next, we evaluated the effect of PPase inhibitors with both a pS375-MOP phosphorylation immunoassay and western blot assay with cells cultured in a multiwell plate. For the western blot analysis, cells were cultured and treated in 96-well plates as described and lysed in detergent buffer with or without PPase inhibitors. MOPs were immunoprecipitated with anti-HA magnetic beads. Immunoprecipitates were washed under magnetic force, and receptors were eluted from the beads into SDS-sample buffer by incubating the plates for 25 min at 43 °C. When these samples were immunoblotted with the anti-pS375-MOP antibody, a concentration-dependent increase in S375 phosphorylation was observed in samples cultured with PPase inhibitors but not in samples lysed without PPase inhibitors (Fig. 2d, top panel). When the blot was stripped and reprobed with the np-MOP antibody, similar levels of MOPs were detected in all the samples irrespective of the presence of PPase inhibitors or agonist exposure (Fig. 2d, bottom panel). For the in-well assay, cells were plated and grown, treated and lysed as in the western blot assay, except that the samples were directly immunoassayed in the plate. Similar to the results obtained by immunoblotting, the results of the assay performed with the anti-pS375-MOP antibody revealed a concentration-dependent increase in signal intensity only in the wells with PPase inhibitor-treated samples (Fig. 2e). In contrast, in wells assayed with the anti-np-MOP antibody, similar signals were observed independent of inhibitor or agonist treatment (Fig. 2f). Notably, a high degree of correlation between the concentration–response curves obtained through the immunoblot analysis and immunoassay was found (Supplementary Fig. 1). These results show that the addition of PPase inhibitors during cell lysis was an essential component of the assay. These results also show that anti-pS375-MOP antibody binding depended on agonist-induced receptor phosphorylation, which needed to be protected from PPase digestion during cell lysis. The anti-np-MOP antibody bound to receptors regardless of their phosphorylation status, and hence, using this antibody appeared to be a feasible means of controlling total receptor content./p>
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